|
|
Vliv cytochromu b5 na enzymovou kinetiku hydroxylace Sudanu I lidským cytochromem P450 1A1
Netolický, Jakub ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Cytochromy P450 jsou jedny z hlavních enzymů přeměňujících xenobiotika. Jsou řazeny mezi monooxygenasy se smíšenou funkcí (MFO). Isoforma 1A1 je extrahepatální forma nacházející se hlavně v plicích, minoritně i v jiných orgánech. Je výrazně indukována polycyklickými aromatickými uhlovodíky a jejich deriváty prostřednictvím Ah receptoru. Jako markerové reakce pro tento enzym lze využít hydroxylace Sudanu I, který se dříve hojně používal jako barvivo v průmyslu. V 80. letech byl prokázán jeho negativní vliv na organismus. NADPH:cytochrom P450 reduktasa je hlavním donorem elektronů pro monooxygenační reakce katalyzované cytochromy P450. Dalším přenašečem elektronů pro reakce katalyzované cytochromy P450 je pak cytochrom b5. Jak již bylo dokázáno, vzájemný poměr reduktasy a cytochromu b5 může mít vliv na přeměnu řady xenobiotik tedy i na hydroxylaci Sudanu I. Tato práce se zabývá vlivem vzájemných poměrů NADPH:cytochrom P450 reduktasy a cytochromu b5 vůči cytochromu P450 1A1 na hydroxylaci Sudanu I. Hlavním úkolem tedy je charakterizovat vliv poměrů elektronového donoru a elektronového přenašeče na hydroxylaci Sudanu I, konkrétně určit kinetické parametry KM a VMAX pro vybrané poměry proteinů. Dílčími úkoly práce pak bylo charakterizovat využívané proteiny a případně je purifikovat, optimalizovat...
|
|
|
Molární poměr cytochromu b5 k jeho reduktasam ovlivňuje aktivitu cytochromu P450 1A1 vůči Sudanu I
Netolický, Jakub ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Dračínská, Helena (oponent)
Cytochromy P450 jsou evolučně velmi starou skupinou enzymů, která zahrnuje celou řadu isoforem a její zástupce lze najít u živočichů, rostlin, hub, bakterií i některých virů. Patří mezi enzymy katalyzující první fázi biotransformace léčiv, polutantů a jiných xenobiotik. Právě z tohoto důvodu patří mezi jedny z nejvíce zkoumaných enzymů a je snahou zmapovat jeho účinky na xenobiotika a léky. Cytochrom P450 potřebuje pro svou funkci donory elektronů, mezi hlavní patří NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasa a cytochrom b5. Alternativní reduktasou která v tomto procesu také participuje je NADH:cytochrom b5 oxidoreduktasa, který je schopná redukovat cytochrom b5. Všechny tyto tři enzymy nacházíme v membránách endoplasmatického retikula, kde spolu přirozeně interagují. Tato práce se zaměřuje na aktivitu lidského rekombinantního cytochromu P450 1A1 vůči karcinogennímu azobarvivu Sudan I, konkrétně mapuje tvorbu hlavních metabolitů v závislosti na vzájemném poměru cytochromu b5 k NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktase a také k NADH:cytochrom b5 oxidoreduktase. Klíčová slova: cytochrom P450 1A1, NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasa, cytochrom b5, NADH:cytochrom b5 oxidoreduktasa, Sudan I, HPLC
|
|
|
Kooperativita složek systému cytochromů P450 a ovlivnění metabolismu léčiv a karcinogenů
Holý, Petr ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Chmelík, Josef (oponent)
Systém oxidas se smíšenou funkcí (MFO systém) hraje důležitou roli v metabolismu mnoha endogenních látek a xenobiotik (např. karcinogenů, léčiv). Membránové hemoproteiny nazývané cytochromy P450 jsou zásadní složkou tohoto systému. Reakce katalyzované cytochromy P450 jsou ovlivňovány působením jiného proteinu MFO systému, a to cytochromem b5 (cyt b5). Mechanismus, jakým cyt b5 působí, ještě nebyl zcela objasněn. Jednou z možností studia této protein-proteinové interakce je metoda kovalentního síťování. Záměnou methioninu ve struktuře cyt b5 za jeho foto-aktivovatelný analog (foto-methionin) je možné připravit analog cyt b5 (foto-cyt b5), který po aktivaci UV zářením kovalentně váže cytochrom P450 v membránovém prostředí. Tato práce se zabývá expresí a izolací rekombinantního analogu cyt b5 s pouze jednou pozicí pro methionin (96) v primární struktuře proteinu a jeho substitucí za foto-methionin. Protein byl purifikován s výtěžkem 6 mg na 1 l bakteriální suspenze. Analýza hmotnostní spektrometrií (MALDI-TOF/TOF) ukázala, že methionin byl v sekvenci substituován foto-reaktivním analogem z asi 30 % (pokrytí sekvence 77 %). Foto- cyt b5 byl použit k fixování transientní protein-proteinové interakce s cytochromem P450 2B4 (CYP2B4). Foto-cyt b5 byl rekonstituován v lipidovém systému s CYP2B4 a...
|
host ::
RSS.